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本试剂盒是一种利用荧光探针DHE进行组织活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的DHE ROS探针为红色荧光的活性氧探针，具有510/610nm的最大激发/发射波长，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、等检测DHE产物荧光，从而测定组织内活性氧水平。本试剂盒只可以用于新鲜组织样本的活性氧检测，不可以用于冻存的组织样本的活性氧检测。

• 使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪检测；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

• 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或荧光酶标仪激发波长488～535nm，发射波长610nm。
  
• 离心机
  
• 移液器
  
• PBS缓冲液/HBSS（不含酚红）
  
• 蛋白定量试剂盒
  
• 黑色透明底96孔板

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• DHE染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 使用前先将本品取出回至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

• 样本处理：
  
  • 刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。
    
  • 准确称取50mg组织，加入1mL匀浆缓冲液A，用玻璃匀浆器充分匀浆。
    
  • 在100×g，4℃离心3分钟，弃沉淀，取上清。
• 样本检测：
  
  • 在96孔板中加入200μL匀浆上清液、2μL DHE探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
    注：
    ① 不同样本的活性氧差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量，一般加入2μL探针，染色终浓度按试剂盒中探针母液的100～2000倍稀释，100～2000倍稀释适合大多数样本。最大稀释比例可至2000倍。
    ② 如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以减少探针用量。保证所有样本探针用量一致即可。
    ③ 以酶标仪检测为例，也可以用荧光分光光度计检测，根据所使用仪器决定匀浆液体积和染色容器。
    ④ 染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
    ⑤ 微量操作时，注意探针要有效加入匀浆液，避免没有加入。
    
  • 在37℃避光孵育15～30分钟。
    
  • 置于荧光酶标仪中，后于激发波长为488～535nm、发射波长610nm检测荧光强度。
    注：
    ① 或者使用荧光分光光度计等其他荧光检测设备。
    ② 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
    ③ 如果荧光强度太强，超过了仪器检测范围，可将孵育后的匀浆上清液稀释后再检测。一般稀释5～50倍。
• 蛋白定量：
  
  • 另取50μL上清匀浆液，用PBS大约稀释30倍。
    
  • 取100μL进行蛋白定量。
• 结果处理：
  以荧光强度（RFU）/蛋白浓度（毫克蛋白）表示组织活性氧强度。
  注：
  ① 数据与蛋白浓度的单位无关。
  ② 此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化处理。
  ③ 荧光强度强则活性氧（ROS）含量高。
  ④ 可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氧（ROS）程度差异。

• 活性氧结果如何分析？
  ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。
  
• 荧光强度在变化？
  可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的样本中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
  注意检测时平行操作即可。